利用10x Genomics Chromium微流控系统 ，实现通过序列标签区别分歧细胞和转录本。微流控系统通路直径很幼一次通过一个细胞。首先在通路中参与带有标签的凝胶微珠 ，单个细胞和单个带有标签的凝胶微珠结合 ，二者被参与的油包裹到一个液滴中 ，形成油包水系统。凝胶微珠上带有大量蕴含凝胶微珠特异性Barcode序劣注分子特异性UMI序列和polyT序列的引物序列 ，将细胞裂解后mRNA分子被引物序列中的polyT捕获 ，扩增后形成携带有Barcode和UMI序列的cDNA ，即可实现将分歧细胞起源的分歧mRNA分子加上标签。
Gel beads在转录组测序中的作用是捕获细胞中的mRNA ，每个微珠表表携带有几十万个Oligo序列（如下图）。Oligo dT序列由4个部门组成：read1用于上机测序；第二段是16bp 的10x barcode序列,每一个Gel Beads都携带分歧的barcode , 可象征获取的mRNA都来自于哪一个细胞；第三段UMI长度为12bp, 能够将转录本序列进行绝对定量 ，预防扩增产生偏好；第四段是30bp的ployT ，用于捕获有ployA尾的转录本。
对造备好的单细胞悬液先进行质检 ，质检合格后与Gel Beads和油别离参与到Chromium Chip G的分歧通路 ，经由微流体“T字”交叉系统形成GEM。接着细胞裂解 ，Gel Beads自动溶诠开释大量引物序列 ，与带有PolyA的mRNA进行逆转录 ，天生带有10x Barcode和UMI信息的cDNA第一链。
样本肇始量与送样建议
|
组织类型 |
新鲜组织、新鲜悬液或速冻组织 |
|
细胞大幼 |
＜40 μm |
|
细胞活性 |
>85%（尽量去除细胞团/碎片/杂质等） |
|
细胞浓度 |
700~1200 cells/μL |
|
细胞总量 |
＞5万 |
当苦衷项：具体样本筹备指南 ，请联系在线客服。
生物信息学分析内容 
代表性文章
【1】Zheng H , Pomyen Y , Hernandez M O , et al. Single cell analysis reveals cancer stem cell heterogeneity in hepatocellular carcinoma[J]. Hepatology, 2018.
【2】Park J , Shrestha R , Qiu C , et al. Single-cell transcriptomics of the mouse kidney reveals potential cellular targets of kidney disease[J]. Science, 2018:eaar2131.
案例展示
Hepatology：单细胞分析显示肝癌干细胞的异质性
论文标题：Single-cell analysis reveals cancer stem cell heterogeneity in hepatocellular carcinoma
登载日期：2018年7月
颁发杂志：Hepatology
影响因子：14.079
钻研机构：美国国度卫生钻研院国度癌症钻研所、曼谷朱拉蓬钻研所、弗雷德里克国度癌症钻研尝试室
样本类型：肝癌细胞系（HuH1和HuH7) ，手术切除肿瘤样本P1
技术伎俩：单细胞测序（10X Chromium、SMART-seq）、流式分选
钻研布景
肝细胞癌（HCC ，hepatocellular carcinoma）的肿瘤内分子异质性部门归因于肝癌干细胞（CSC ，hepatic cancer stem cells）的存在。 由各类细胞表表标志物界说的分歧CSC群体可能蕴含分歧的致癌驱动成分 ，这在界说靶向疗法时组成了挑战。 钻研人员在单细胞水平（10X Chromium、SMART-seq）上整合转录组学和职能分析用以评估CSC的异质性水平。了局批注 ，CSC在单细胞水平上的表型、职能和转录均存在异质性性 ，分歧的CSC亚群拥有分歧的分子特点。并且有趣的是 ，分歧CSC亚群内的分歧基因与HCC预后有关 ，并且彼此相互独立 ，批注CSC异质性影响肿瘤内异质性和肿瘤进展。
文章了局
大量数据批注CD13、CD24、CD44、CD90、CD133、EpCAM等表表标志物能够界说CSC ，钻研人员选择CD24、CD133、EpCAM分选HuH1和HuH7分歧细胞亚群 ，用于钻研CSC生物学和分子水平异质性。免疫荧光染色批注 ，在两种细胞造就状态下（单层造就、球体造就）,两个HCC细胞系均阐发出显著的细胞异质性。
HuH1和HuH7细胞系（原始细胞数别离是1343、1134）正常造就和缺氧造就（推进细胞干性）2周后 ，钻研人员遵循三种表表标志物（CD24、CD133、EpCAM）分选细胞 ，HuH1和HuH7中标志物阳性的CSCs比例别离为15-20%、8-12% ，而标志物阴性CSCs比例只有0-5%（下图A-B） ，造就后分歧细胞亚群的自我更新能力差距很大（下图C-D）； 分选后的细胞经过1个月造就后 ，和未分的得细胞相比 ，CD133+、EpCAM+、CD24+、Triple+细胞可能扩大成为混合CSCs ，而存活下的Triple-细胞可能扩大成混合CSCs ，可能是由于部门细胞不是真正的象征阴性细胞 ，或者象征阴性细胞经历了转换变为象征阳性细胞（下图E）。
钻研人员选取SMART-Seq方式分析HuH1和HuH7阳性象征细胞以及分选的P1（分选CD133+/CD24+/EpCAM+/CD45-细胞）细胞表白谱（单个细胞测序、10细胞混合测序、100细胞混合测序）信息 ，并与数据库中人胚胎干细胞（hESC）、鼠内皮细胞（mEC）和鼠造血干细胞（mHSC）表白谱数据做了比力 ，发现分歧细胞类群拥有分歧的基因表白模式 ，且分歧类型细胞中每个细胞的基因表白模式均存在差距 ，HuH7细胞间差距大于HuH1；当细胞混合（10细胞混合、100细胞混合）后这种差距水平显著降低（下图A）。而当单独聚类HuH7细胞时 ，发现分歧象征细胞彼此能够分辨（下图B）。以上数据均批注单细胞水平上转录组存在异质性。
钻研人员比力了HuH7阳性象征细胞（Triple+）和阴性象征细胞（Triple-）基因表白差距 ，鉴定到的286个Triple+有关基因能够预测来自LCI队列的240例肿瘤样本、来自TCGA的250例肿瘤样本的整体生计率 ，但在非肿瘤样本中无意思。
分歧象征CSC细胞群体基因表白比力分析 ，EpCAM+、CD133+、CD24+、Triple+特点基因根基不沉合（下图A） ，IPA通路分析也批注分歧细胞群体的通路也不沉合（下图C-F） ，并且分歧细胞群体特点基因能够用于生计期预测 ，且EpCAM+、CD133+比CD24+更有优势（下图B）。
为了整体相识细胞群体多样性 ，钻研人员选取10X 单细胞测序方式 ，对3847个HuH1、HuH7、P1细胞进行了分析 ， HuH1能够分为2个亚群 ，HuH7分为4个细胞亚群 ，P1分为3个细胞亚群 ，细胞聚类了局与与SMART-seq了局类似（下图A）。CSC标志物 ，例如EpCAM、CD133 (PROM1)、CK-19 (KRT19) 和乙醛脱氢酶 (ALDH1A1) （下图B）以及HCC特异基因 ，AFP、MDK、GPC3、GOLM1、YY1AP1、PLK1, ECT2、NELFE（下图C）在分歧细胞亚群中表白存在异质性。P1的3个细胞亚群中表白了山中因子 (KLF4、POU5F1、MYC) ， 干细胞marker (NANOG) ，白细胞marker(PTPRC), T细胞 markers (CD3E, CD8A) 和B细胞marker (CD79A) ，但其表白也存在异质性 ，其中第一个和第二个P1亚群为HCC浸润白细胞（别离表白T细胞marker和B细胞marker） ，第三个P1亚群重要为HCC细胞（下图D）。
参考文件
Hongping Zheng,et al. Single cell analysis reveals cancer stem cell heterogeneity in hepatocellular carcinoma.?Hepatology, 2018, doi：10.1002hep.29778
了局展示
1. 单细胞亚群分类
针对PCA了局中拔取前10个主成分 ，选取graph-based聚类步骤对细胞进行分类。使用一样的数据进行t-SNE分析 ，而后将聚类了局在t-SNE映射中展示。
2. Marker基因分析
细胞群体Top10 Marker基因的幼提琴图和表白映射图
3. 差距基因KEGG富集性分析
Pathway通路图展示与注明：红色代表注解到某个ko节点且上调的显著差距表白转录本 ，蓝色代表注解到某个ko节点且下调的显著差距表白转录本 ，橘黄色代表注解到某个ko节点不仅有上调又有下调的显著差距表白转录本。方框内的4位数字暗示各类酶的EC编号；空心圆圈暗示幼分子化合物；实心箭头暗示生化反映的方向；虚线箭头衔接其他的有关代谢蹊径。下图仅为汇报中的展示图片
常见问题（FAQ）
1、单细胞转录组测序必要做沉复吗？
单细胞测序的主张在于鉴定细胞群体中的分歧亚群、得到新的沉要分子标志物和鉴定罕见细胞亚群等 ，因而更多的是关注细胞和细胞之间的差距。从目前已有的文件看 ，对沉复数没有强造要求。但从近期的发文趋向来看 ，建议每组设置样本数3~5 个 ，临床样本凭据现实情况建议每组 5 例以上。
2、组织样本若何造备单细胞悬液？
单细胞转录组测序目前没有一个统一的样本造备步骤 ，针对于分歧的组织样本 ，有分歧类型的样本单细胞造备步骤。此表 ，能够具体凭据教员提供的具体样本类型 ，查阅有关的文件 ，探求适合于教员样本的单细胞悬液造备步骤。
3、单细胞转录组每个细胞能捕获到几多个基因？
凭据分歧的细胞类型 ，捕获到的基因数会有区别 ，有些细胞类型高的会在3000左右 ，而有些或许在1000左右；蚣斐鍪胙咀刺泄 ，分歧类型的样本 ，基因检出数可能存在数倍的差距。
