一、钙离子成像技术（Calcium imaging）  

  钙离子成像技术（Calcium imaging）是指利用钙离子批示剂监测组织内钙离子浓度的步骤
。在神经系统钻研中，我们常用钙离子成像技术监测神经元内钙离子的变动，提醒神经元活动
。有了钙成像技术，正本悄无声息的电生理活动就造成了一幅形象地、斑斓闪动的壮观影像，钻研人员能够同时大量追踪神经元活动，钻研其关系，因而被全世界神经科学家们追捧
。

  

  图1.钙离子成像技术  

  1）钙离子成像技术道理  

  在生物体内，钙离子是细胞信号产生的基础，在好多职能方面有沉要作用
。在哺乳动物的神经系统中，钙离子是一类沉要的神经元胞内信号分子，神经元静息状态下，胞内钙离子浓度约为50-100nM，而当神经元活动的时辰，胞内钙离子浓度能上升10-100倍，而钙离子对于突触囊泡开释必不成少；神经元在放电的时辰会发作出一个短暂的钙离子浓度顶峰，这意味着神经元钙离子浓度表征突触传递和神经元活动
。  

  图2 神经元钙离子浓度表征突触传递和神经元活动示意图  

  因而，神经元钙离子成像技术的道理就是借助钙离子浓杜纂神经元活动之间的严格对应关系，利用特殊的荧光染料或者蛋白质荧光探针（钙离子批示剂，Calcium indicator），将神经元中钙离子的浓度通过荧光强度阐发出来，并被显微镜捉拿，从而达到监测
神经元活动的主张（图3）
。  

  因而，钙离子成像技术的主题在于钙离子批示剂，此刻宽泛使用的钙离子批示剂有化学性钙离子批示剂（chemical indicators）和基因编码钙离子批示剂（genetically-encoded indicators）两类：

  1、化学性钙离子批示剂：指的是能够螯合钙离子的幼分子，所有这些幼分子都基于BAPTA（氨基苯乙烷四乙酸），BAPTA可能特异性地和钙离子螯合，而不会和镁离子螯合，所以被宽泛地用作钙离子螯合剂
。目前较为成熟的化学性钙离子批示剂蕴含Oregon Green-1、Fura-2、Indo-1、Fluo-3、Fluo-4
。  

  2、基因编码钙离子批示剂：这些批示剂是来自于绿色荧光蛋白（GFP）及其变异体（例如循环分列GFP、YFP、CFP）的荧光蛋白质，与钙调蛋白（CaM）和肌球蛋白轻链激酶M13域融合
。此刻使用较宽泛的基因编码钙离子批示剂有：GCaMP、Pericams、Cameleons、TN-XXL和Twitch，其中GCaMP6由于它有着超强的敏感度，此刻被宽泛利用于活体钙成像钻研，其发出荧光的道理在于钙离子浓度上升导致M13与CaM结合，从而扭转cpEGFP的构象，将其从无荧光的状态变为绿色荧光

  

  图3 GCaMP蛋白的根基结构和道理（来自WIKI）  

  2）常见的钙离子批示剂  

  1、GCaMP6系列：  

  第六代GCaMP蛋白（GCaMP6）有三种分歧亚型：GCaMP6s、GCaMP6m、GCaMP6f，其特点各不一样（图4）
。GCaMP6s高敏感，适合低频信号的批示，；GCaMP6f有急剧动力学曲线，解离最快，适合高频信号的批示，必要凭据尝试需要进行选择
。

    

图4 几种分歧GCaMP蛋白的个性（Douglas S. Kim, et al., Nature, 2013）  

  2、jGCaMP7家族：  

  jGCaMP7（Janelia GCaMP7，区别于从前出现过的G-CaMP7）
。蕴含四类分歧特点的蛋白：jGCaMP7s、jGCaMP7f、jGCaMP7b、jGCaMP7c（图5）
。jGCaMP7s高敏感；jGCaMP7f拥有急剧动力学曲线，合用于更强的检测单作为电位反映或群里活动尝试；jGCaMP7b拥有较明亮的布景荧光，合用检测神经元突起或神经纤维；jGCaMP7c的本底荧光最低，对比度高，信号清澈，合用于大领域成像
。  

  

图5 jGCaMP7蛋白的反映特点（Douglas S. Kim, et al., bioRXiv, 2018）  

  3、XCaMP系列：  

  基于CaMKK为骨架，通过一系列的突变筛选，蕴含四种分歧色彩：蓝色的XCaMP-B，绿色的XCaMP-G，橙色的XCaMP-O和红色的XCaMP-R（图6）
。其中XCaMP-G的荧光强度比GCaMP6强，作为电位刺激诱发的钙离子反映机能也比GCaMP6有显著提高
。结合特定的神经元特异的表白步骤，可实此刻自由活动状态下同时监测特定行为中三种分歧神经元类型的活动；结合双光子显微镜，进行微结构职能成像，实现对突触前和突触后结构同时双色成像
。

  

  图6 XCaMP蛋白特点（Haruhiko Bito’s, lab.,cell, 2019）  

  4、CaMPARI：  

  一种可能两全全局和微观的新型钙成像技术， 蕴含CaMPARI以及CaMPARI2（第二代）
。其道理在于，CaMPARI蛋白在正常状态下会发出绿色荧光，而若是对这种蛋白同时使用高浓度钙离子与紫表光处置，它就会不成逆、永远地转造成另一种能发出红色荧光的构象，即实现将瞬间的神经元活动造成永远的红色荧光蛋白表白（图7）
。钻研人员通过转基因技术将这种新型蛋白导入到尝试动物的神经系统中，而后用高强度的紫表光照射动物的大脑，通过查抄荧光，找到发红色荧光的神经元，这些神经元即是在紫表光照射期间活跃的神经元
。由于紫表光能够对着整个大脑进行照射，所以理论上，人们能够对全脑进行查抄
。

  

  图7 CaMPARI技术道理（Eric R. Schreiter, et al., Science, 2015）  

  5、jRGECO1a&RCaMP：  

  红色的钙离子敏感蛋白，能够同GCaMP一路使用，象征统一幼鼠统一脑区两类细胞的活动分歧的神经元类型
。  

  6、GCaMP-X：  

  无危险钙离子探针，可；ひ览涤贚型钙通路的兴奋-转录耦合免受滋扰，同时仍阐发出部门GCaMP的良好Ca2+感应个性
。  

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。
。
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  二、电压成像（voltage imaging）  

  细胞内钙离子浓度变动和细胞膜电位的变动是细胞活动的两个沉要指标，由于钙信号衰减较慢，并不能充分表征神经元的作为电位，并且阈值以下的电压信号齐全被忽略，因而科学家们利用细胞膜电位扭转作为信号进行荧光成像
。

  1)电压成像技术道理  

  细胞膜电位变动是细胞活动最根基的信号，当膜电位变动时，细胞膜上镶嵌的很多蛋白质分子城市扭转状态，这类随膜电位扭转状态的蛋白分子叫电压敏感元件
。而电压成像技术道理就在于将电压敏感元件和荧光蛋白衔接起来，当膜电位扭转时，电压敏感蛋白的扭转就会影响荧光蛋白的结构，从而扭转了后者的发光个性
。这样就能够利用荧光来看神经细胞膜的膜电位变动了
。  

  遗传编码的荧光电压批示剂（Genetically encoded voltage indicators, GEVIs）刷新于一种细菌能吸收阳光的蛋白质--古紫质Archaerhodopsin，其能随着细胞膜电位扭转发出荧光
。通过GEVIs我们能够成像神经元的急剧放电信号与阈下电活动，能实时监测细胞膜电位的颠簸，相迸宗钙指标，更能直接反映神经元的活性
。

  

  图8 三种类型GEVIs的示意图（Storace, D., et al., Trends Neurosci, 2016）  

  Voltron，是一种新型电压批示剂，分歧于传统的GEVIs依赖于微生物视紫红质或荧光蛋白（这些荧光基团不足亮杜纂光不变性），Voltron利用明亮且耐光型的合成染料
。其道理在于Voltron将电压敏感性微生物视紫红质结构域和自象征蛋白象征域结合染料结合，后者可共价结合一种人为荧光染料配体，合成染料给药方式单一，且可跨血脑樊篱
。体内同时成像神经元的数量扩大10倍，且成像功夫越发悠久
。

  

  图9 Voltron结构的示意图（Eric R. Schreiter’s lab., science, 2019）  

  神经元职能成像是探索神经元编码各类职能的沉要科学伎俩，宽泛利用于神经生物学等各个钻研领域，目前最常用步骤为钙成像和电压成像
。得益于双光子成像技术，通过纪录细胞内钙离子浓度变动或细胞电位变动，实时反映细胞活动，实现了一系列行为动物活体动态职能成像技术！  

  三、神经递质荧光探针  

  在已知宇宙中，脑可能是最复杂的物体之一
。凭据前人的估计，优德88脑约莫有1010-1012个神经元和1011-1013个胶质细胞，同时每个神经元占有103-104个突触与其他神经元形成联系
。神经递质作为突触间传递信息的沉要“信使”，在神经元与细胞之间的通讯互换中起到关键的媒介作用，神经递质的错乱时时伴随各类疾病的发生
。因而,对神经递质的探测追踪是钻研大脑职能和有关疾病的沉要环节
。然而，若何在拥罕见十亿个神经细胞、数万亿个突触衔接的大脑中精确检测神经递质的开释，是悠久以来困扰科学家的一个难题
。  

  北京大学李毓龙团队利用可与神经递质相结合的G蛋白偶联受体作为探针的骨架，将荧光蛋白（cpEGFP）与特异性的人源神经递质受体奇妙地进行分子水平的融合和刷新，成功开发出新型可遗传编码的一系列神经递质荧光探针
。  

  1）神经递质荧光探针道理  

  这一系列神经递质探针道理类似，都是基于人源神经递质受体，其道理在于把cpEGFP嵌入特定的神经递质受体，受体与神经递质结合后会引发受体构象扭转转换为荧光信号（图10）
。  

  目前通过病毒注射、转染等技术伎俩，能够将这种可遗传编码的探针表白在细胞或幼鼠脑部，借助成像技术，观察神经递质浓度的实时变动
。这类神经调质探针拥有极高的活络度、分子特异性、精确的空间分辨率和亚秒级响应速度，已在果蝇、斑马鱼
。幼鼠脑部十几种神经元上得到验证，这将为钻研大脑的职能以及神经系统疾病机造的解析提供沉要的工具
。

  

  图10 GACh道理（Yulong Li’s lab., Nat Biotechnol, 2018）

  2)常见的神经递质荧光探针  

  1、DA  

  多巴胺是大脑中一种沉要的神经递质，调控蕴含进建、影象、活动等一系列关键职能，多巴胺失调会导致心灵疾病或神经退行性疾病，多巴胺探针蕴含：DA1h和DA1m两种版本，别离对应高/低亲和力，合用于多巴胺开释量分歧的脑区（图11）
。

  

  图11 GRABDA sensors表白在细胞和神经元中（Yulong Li’s lab., cell, 2018）  

  2、Ach  

  乙酰胆碱是人类发现的第一种神经递质，掌管调节睡眠、成瘾、进建影象等过程
。乙酰胆碱信号传递变态，会导致先性子肌肉萎缩、糖尿病、阿兹海默症等疾病
。GACh2.0对生理浓度乙酰胆碱拥有高信噪比、高活络性的光学信号变动响应，并且拥有亚秒级动力学及高度分子特异性，可实现对时空特异性乙酰胆碱信号的精确指征（图12）
。

  

  图12 GACh2.0 sensors个性（Yulong Li’s lab., Nat Biotechnol, 2018）  

  3、NE  

  去甲肾上腺素作为一种沉要的单胺类神经递质，参加感触信号的调节、把稳力调控、睡眠于醒觉、进建影象等生理过程，去甲肾上腺素开释或信号传递的受损与一系列的心灵疾病和神经退行性病变息息有关
。去甲肾上腺素探针蕴含：NE1m和NE1h两种版本，别离对应高/低亲和力，合用于检测部门突触传递和非部门非突触传递的去甲肾上腺素开释（图13）
。

  

  图13 GRABNE sensors表白神经元（Yulong Li’s lab., Neuron, 2019）

  此表，李毓龙教授团队在积极开发更多新的神经递质、神经肽蹬撰光探针
。  

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  成像技术利用案例  

  1、GCaMP6f  

  客户颁发文章：Science. (IF=41.058). Ren S,et.al. (2018). The paraventricular thalamus is a critical thalamic area for wakefulness. [腺有关病毒, 醒觉]

  注射部位：幼鼠PVT  

  载体：AAV-CaMKIIα-GCaMP6f  

  注射体积：100nl  

  观察功夫：4周  

  2、GCaMP6s  

  ① 客户颁发文章：Science. (IF=41.058). Mu D,et.al. (2017). A central neural circuit for itch sensation. [腺有关病毒, 痒, 光遗传, 化学遗传，钙成像]

  注射部位：幼鼠PBN  

  载体：AAV-hSyn-GCaMP6s  

  血清型：rAAV2/9  

  病毒滴度：5.3x1012 VG/mL  

  注射体积：300nl  

  观察功夫：3周  

  ② 客户颁发文章：Nature Neuroscience. (IF=19.912). Yao J,et.al. (2018). A corticopontine circuit for initiation of urination. [腺有关病毒, 神经环路]

  注射部位：幼鼠皮层M1、PMC  

  载体：rAAV2/1-hSyn-Cre&rAAV2/9-DIO-hChR2(H134R)-mCherry、rAAV2/9-DIO-GCaMP6s  

  病毒滴度：rAAV2/1: 5 × 1012 VG/mL；rAAV2/9-DIO-hChR2：1.2 × 1013 VG/mL；rAAV2/9-DIO-GCaMP6s：0.5 × 1012 VG/mL  

  注射体积：多点注射，每位点30-40nl  

  观察功夫：4周  

  3、GCaMP5G  

  客户颁发文章：Neuron. (IF=14.319). Han Q,et.al. (2018). A Visual-Cue-Dependent Memory Circuit for Place Navigation. [AAV, 进建与影象, 钙成像]

  注射部位：幼鼠MECII  

  载体：pAAV-Syn-GCaMP5G  

  血清型：rAAV2/9  

  注射体积：约100nl  

  观察功夫：4周