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慢病毒

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腺有关病毒

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疾病钻研（心、肝、肺）

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疾病钻研（心、肝、肺）

基于对病毒载体的深刻相识和研发，越来越多的科研人员起头借助病毒载体进行疾病钻研。目前，病毒载体工具在分歧组织器官中均有大量的利用，通过使用工具病毒载体，对疾病有关基因进行定向和组织特异性的刷新和操控，已成为科研人员进行疾病钻研与医治的一种技术伎俩。

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病毒载体的选择

分歧病毒载体的大幼迥异，意味着其内含基因容量存在巨大差距；免疫原性的分歧，意味着其体内/体表利用的场景必要轻微调整；表白功夫和周期的分歧，意味着我们必要凭据钻研需要进行相对应的选择。

表1 分歧病毒的生物学个性比力

	慢病毒	腺有关病毒	腺病毒	逆转录病毒
包膜	有	无	有	有
颗粒直径	80-100 nm	20-30 nm	90-100nm	~100nm
基因组	dsRNA	ssDNA	dsDNA	RNA
基因组大幼	9.75kb	4.7kb	36kb	~5kb
表白肇始功夫	48-72h	72-96h	24-48h	48-72h
表白持续功夫	> 2 months	> 6 months	< 1 month	> 2 months
体内扩散能力	通常	强	强	通常
免疫原性	中等	极低	强	中等
滴度领域	10⁸~10⁹TU/mL	10¹²-10¹³VG/mL	10¹¹-10¹²PFU/mL	10⁷~10⁸TU/mL
滴度检测步骤	qPCR整合DNA	qPCR非整合DNA	抗原抗体免疫染色试剂盒	qPCR整合DNA
整合方式	随机高频整合	定向低频整合（rAAV不整合）	非整合	随机整合
利用领域	体表细胞习染，gRNA文库筛选，体内	基于分歧的血清型，体内宽泛利用	嗜肝，急剧表白或短期表白，血液、心脏，细胞系等	特异性只习染割裂期的细胞

沉组腺有关病毒载体（rAAV），一向是体内钻研的明星载体，除了其免疫原性极低、安全性高、宿主细胞领域广、扩散能力强、体内表白基因功夫长蹬着势表，还在于其种类多样性。

此刻钻研中常用的rAAV就是利用AAV2型基因组与分歧的衣壳蛋白结合产生的混合体病毒载体，通常象征为rAAV2/N (N为分歧的衣壳血清型)。沉组的病毒拥有AAV2型的不变表白和基因整合能力，同时获得了分歧血清型的组织习染嗜亲性，阐发出肯定的器官靶向特异性。

表2 分歧血清型AAV的组织嗜亲性

血清型	组织亲和性
rAAV2/1	神经系统（高滴度顺向跨突触），肌肉，骨骼肌，心肌，滑润肌
rAAV2/2	神经系统，肌肉，肝脏，血管滑润肌，眼
rAAV2/3	肌肉，肝脏，肺，眼
rAAV2/4	神经系统，肌肉，眼，脑
rAAV2/5	神经系统，肺，视网膜，肝脏，滑膜关节
rAAV2/6	神经系统，肺，肌肉，心脏
rAAV2/7	肌肉，肝脏
rAAV2/8	神经系统，肝脏，胰腺，视网膜，脂肪组织
rAAV2/9	神经系统，心肌，肺，视网膜，皮肤，肌肉，脂肪组织
rAAV2-retro	神经系统（逆向非跨突触）
AAV-PHP.eB	跨血脑樊篱（静脉注射）
AAV-PHP.S	全表周神经（尾静脉注射）
AAV-PAN	胰腺（腹腔注射）
AAV-LUNG	肺（尾静脉注射）
AAV-DJ	视网膜，肺，肾脏，体表习染细胞
AAV-7m8	视网膜
AAV-ShH10Y	视网膜Muller细胞
AAV-Rh10	肝脏，血液，心脏，体表习染细胞
AAV-Anc80L65	内耳、视网膜、骨骼肌、肝脏
AAV-SCH9	SVZ区神经干细胞

幼建议：如您不确定选择哪种血清型，可尝试使用优德88生物Pandora’s Virus （AAV试用装）进行预尝试，通过比力分歧血清型对指标组织的习染成效，摸索最佳尝试前提（注射步骤、注射位点、病毒用量等），以便得到更梦想的尝试了局。（链接到Pandora’s Virus＞＞）

肝脏

肝脏是调控机体脂质代谢、血糖代谢的沉要器官，其职能异；岬贾轮靖巍⒏叩ü檀佳ⅰ⒏哐ⅰ⑻悄虿〉燃膊。

1、注射方式

利用病毒载体习染肝脏通常选取尾静脉注射的方式。

依照优德88生物多年的经验，使用AAV载体习染肝脏组织通常拔取AAV2/8血清型，通过尾静脉注射伎俩习染肝脏每只幼鼠必要注射1x10¹⁰总滴度的病毒载体。

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优德88生物AAV习染了局

2、利用案例

2.1 肝脏特异启动子TBG

客户颁发文章：FASEB Journal. (IF=5.391). Yang Y,et.al. (2018). Long-term exercise prevents hepatic steatosis: a novel role of FABP1 in regulation of autophagy-lysosomal machinery. [非酒精性脂肪肝，自噬溶酶体，腺有关病毒过表白]

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注射方式：幼鼠尾静脉注射

载体：AAV8-TBG-Fabp1

血清型：rAAV2/8

注射量：200ul，2× 10¹¹ VG

观察功夫：1周

2.2 Cre-loxp技术在幼鼠肝脏中的利用

由于腺病毒高度嗜肝，险些90%以上会习染肝脏，因而腺病毒能够作为肝脏特异性习染的有效载体。将Cre腺病毒（Ad-Cre）通过尾静脉注射入带有loxp幼鼠体内，即可实现肝脏特异性表白并将主张基因敲除，从而急剧获取肝脏特异性基因敲除幼鼠。

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2.3 CRISPR/Cas9技术在幼鼠肝脏中的利用

通过腺病毒将CRISPR/Cas9系统有关元件（Cas9和sgRNA）注射入幼鼠体内，能够实此刻肝脏中特异性表白，并实现肝脏部位的特异性敲除。此步骤比力适合检验活体尝试。

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胰腺

胰腺是一个兼有内、表排泄职能的器官，与机体消化、血糖代谢、脂质代谢蹬仔亲昵的关系，也是代谢钻研的关键指标器官之一。

在现实钻研中，使用病毒载体习染胰腺重要有两种方式，一种是使用AAV2/8病毒载体，通过胆管将病毒注射入胰腺；另一种新步骤是使用优德88生物新研发的AAV-PAN病毒载体，腹腔注射习染胰腺：

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优德88生物AAV-PAN习染了局

心脏

1、注射方式

AAV的注射方式，分歧的文章当选取了不一样的注射方式。总体上，通常蕴含静脉注射、心腔内注射、心肌内定点注射、心包内注射（介于心肌与心包膜之间），其中静脉注射蕴含尾静脉注射、颈静脉注射、面部静脉注射等。

尾静脉注射和心腔内注射由于病毒流进血液循环，散布较均匀。心腔内注射必要结合自动脉嵌夹进行，由于开胸腔手术必要辅助呼吸，敌手术操作要求较高。心肌内定点注射时每点注射2-5ul，成效是在注射的部门点左近表白较高，但扩散极度有限。总的来说，好多尝试直接用尾静脉注射即可，但是可能必要较高剂量的病毒，若是用心肌内定点注射，即幼量多点注射，能够达到很好的习染表白成效，但是后者操作技术难度略高，也必要破费更长的操作功夫。

结合新生鼠（诞生2-10天）注射成效比力来看，新生鼠注射表白成效大大优于成年鼠，亏损病毒剂量也相对较低。新生鼠的注射，通常凭据尝试室的前提来看，能够选择颈静脉注射、面部静脉注射和心腔内（左心室）注射，主张是将病毒导入血液循环中。

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2、启动子选择

一些常用启动子如CMV、CAG、αMHC、cTnC等常被用于驱动在心脏组织中的表白。好多高效的启动子由于片段较大，如αMHC，仅用于转基因幼鼠等尝试，不适合装载在AAV载体上。通过查阅文件，我们发现一些幼的启动子如CMV在心脏组织的表白能力比力强，出格对于大片段的驱动成效很显著，但是若是必要介导的主张基因在心脏中特异性表白，则推荐使用cTnT启动子，cTnT常被用于心肌的特异性表白，表白能力也很强。

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3、利用案例

3.1 心脏特异性启动子cTNT

客户颁发文章：Yue Z, et al., (2019) PDGFR-b Signaling Regulates Cardiomyocyte Proliferation and Myocardial Regeneration. Cell Rep.

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注射方式：

载体：AAV9

血清型：rAAV2/9

启动子：cTnT

注射量：200ul，2× 10^{11^VG}

观察功夫：1周

3.2 Cas9心脏特异性转基因幼鼠

科学家构建了带有eSpCas9（1.1）的心脏特异性转基因幼鼠，通过Myh6基因的启动子（αMHC）驱动Cas9在心肌的特异性表白。αMHC启动子是心脏特异性转基因幼鼠常用启动子。这个工具幼鼠可能解决尝试过程中Cas9在心脏递送和表白的难题。转基因幼鼠能够维持Cas9在心脏持久高水平的表白，而这个正是CRISPR/Cas9系统在心脏部位编纂效能不高的症结地点。

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Cas9转基因幼鼠，只必要通过AAV递送sgRNA到心脏表白即可实现，这种步骤能够获得比力高的编纂效能。钻研人员将靶向Myh6基因表显子sgRNA通过装载在AAV载体上注射入幼鼠，实现心脏特异性敲除。Myh6表白水平降低50%以上，同时成功得到发生心肌肥厚和扩张型心脏的突变幼鼠。

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肺部

目前对于肺部的病毒习染，普遍选取AAV病毒载体，使用病毒载体习染胰腺重要有两种方式，一种是使用AAV2/9病毒载体，通过鼻内或气管内递送（经呼吸路）将病毒通过肺呼吸路递送，参考剂量是1×10¹¹VG病毒，体积50ul；另一种新步骤是使用优德88生物新研发的AAV-LUNG病毒载体，尾静脉注射特异性习染肺部：

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优德88AAV-LUNG习染肺部了局

肌肉

目前，对于肌肉组织中使用的病毒载体通；嵫∮肁AV病毒载体，由于AAV不仅可能高效特异地靶向肌肉组织，且能在肌肉组织中表白悠久。腺病毒使用时容易引起较强的免疫反映，并且很容易被断根，表白功夫比力短暂，较少被利用于肌肉组织的靶向表白。只管慢病毒习染表白领域宽泛，对造就的肌肉细胞均能高效表白，但是对肌肉组织的习染表白极度有限。目前靶向肌肉的AAV载体血清型重要为AAV1，AAV6和AAV9。其中，AAV9的表白效能最高，并且更容易钥洹肉中高表白。

1、注射方式

利用病毒载体习染肌肉组织进行钻研，通常分为系统注射和肌肉内注射，系统注射表白较均匀，但是大部门病毒会被其他脏器组织吸收，导致靶向肌肉的病毒较少。肌肉内注射是一种定点注射，能够在注射点左近高效表白，但弊端是病毒扩散极度有限，因而往往必要多点注射，通常每个点在5-10ul。

2、利用案例

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注射方式：静脉注射

载体：AAV-CMV-miniDystrophin

血清型：rAAV2/9

观察功夫：16周

脂肪组织

脂肪组织由大量脂肪细胞组成，分为白色脂肪、棕色脂肪和米色脂肪组织，脂肪组织是机体冗余能量贮存的沉要器官，同时也是沉要的排泄器官，在机体的血糖代谢、脂质代谢、慢性炎症、伤疤建复等中有沉要的生理职能。

钻研中，若是我们使用病毒载体习染脂肪组织，通常选取定点注射的方式。使用AAV病毒载体习染脂肪组织通常拔取rAAV2/8血清型，在脂肪组织的多点注射中，每个点注射量约莫1x10¹⁰总滴度的病毒载体。

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AAV习染脂肪

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