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  非编码RNA（Non-coding RNA）是指不编码蛋白质的RNA，蕴含miRNA、lncRNA、circRNA、piRNA等。非编码RNA阐扬职能的方式好多，能够与蛋白、DNA和RNA相互作用，参加多种细胞活动，重要蕴含基因的激活和寡言，RNA的剪接、建饰和编纂，蛋白质的翻译等。

  1.miRNA：miRNA是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子，它们在动植物中参加转录后基因表白调控。每个miRNA能够有多个靶基因，而几个miRNA也能够调节统一个基因。

图一 miRNA成熟及作用方式（Mikhailidis DP, Athyros VG. Nat Rev Cardiol. 2014 Feb;11(2):72-4.）

   miRNA过表白：将miRNA前体序列构建入病毒载体中，该载体既可用于瞬时转染细胞，也能够包装成病毒用于不变株筛选和动物水平过表白miRNA。

  miRNA敲低：设计针对miRNA的TuD RNA封关片段或海绵片段，再将该片段构建入病毒载体中。该载体除了能够直接瞬时转染细胞用于miRNA的敲低，也能够包装成慢病毒，用于动物水平敲低miRNA。

  miRNA靶基因预测：miRNA通过碱基互补配对的方式鉴别靶基因的3’UTR区，并凭据互补水平的分歧领导寡言复合体降解靶mRNA或者阻挠靶mRNA的翻译。因而，能够将主张基因的3’UTR区域构建到含luciferase的汇报基因上，通过比力miRNA过表白或inhibitor 与汇报基因作用检测荧光值的变动，判断miRNA对靶基因的作用。再通过对3’UTR区进行定点突变的步骤进一步确定miRNA与靶基因3’UTR的作用位点。

  miRNA常用数据库：

   （1）miRbase（http://www.mirbase.org）：miRbase 是由曼彻斯特大学的钻研人员开发的一个在线的miRNA数据库，提供蕴含已颁发的miRNA序列数据、注解、预测基因靶标等信息的全方位数据库，是存储miRNA信息最重要的公共数据库之一。

  （2）TargetScan（http://www.targetscan.org/）：TargetScan是通过搜索和每条miRNA种子区域匹配的守旧的8mer和7mer位点来预测靶基因。

  （3）TarBase（http://carolina.imis.athena-innovation.gr/diana_tools/web/index.php?r=tarbasev8%2Findex）：TarBase数据库人为经历了长达10年左右的功夫去网络了尝试验证过的miRNA的靶基因，蕴含在人、幼鼠、果蝇、蠕虫和斑马鱼中的miRNA的靶基因。

  （4）miRWalk（http://www.ma.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk/）：miRWalkis是一个综合性数据库，提供来自人类、幼鼠和大鼠的miRNA的预测信息和经过验证的位于其靶基因上的结位点。

  2.lncRNA：lncRNA是长链非编码RNA（long non-coding RNA）的简称，是长度在200-100000 nt之间的RNA分子。大无数的lncRNAs在组织分化发育过程中，都拥有显著的时空表白特异性；序列上守旧性较低，只有约12%的lncRNA可在人类之表的其它生物中找到。

  凭据lncRNA在基因组上相对于蛋白编码基因的地位，能够将其分为启动子区（promoter associated）、内含子间（intronic）、双向（bidirectional）、正义链（sense）、反义链（antisense）、3’UTR区（3’UTR associated）、基因间（intergenic）这7种类型。这种地位关系对于揣摩lncRNA的职能有很大援手。

  图二 lncRNA分类（Huang X, et al.Cancer Lett. 2018 Jan 28;413:94-101.）

  通常来说，lncRNA重要从以下三种层面实现对基因表白的调控：

  （1）表观遗传学调控：lncRNA招募染色质沉构复合体到特定位点进而介导有关基因的表白寡言。

  （2）转录调控：蕴含如下几种：1）lncRNA的转录可能滋扰邻近基因的表白；2）lncRNA可能通过封阻启动子区域来滋扰基因的表白；3）lncRNA可能与RNA结合蛋白作用，并将其定位到基因启动子区从而调控基因的表白；4）lncRNA可能调节转录因子的活性；5）lncRNA也可能通过调节根基转录因子来实现调控基因的表白。

  （3）转录后调控：lncRNA可能在转录后水平通过与mRNA形成双链的大局调控基因的表白。

  lncRNA过表白：将lncRNA序列构建入病毒载体中，该载体既可用于瞬时转染细胞，也能够包装成病毒用于不变株筛选和动物水平过表白lncRNA。

  lncRNA滋扰：针对lncRNA设计滋扰片段，再将该片段构建入病毒载体中。该载体除了能够直接瞬时转染细胞用于lncRNA的滋扰，也能够包装成慢病毒，用于动物水平滋扰lncRNA。

  lncRNA敲除：用CRISPR/Cas9技术对lncRNA进行敲除。针对lncRNA某条片段的两端别离设计多条sgRNA序列，实现大片段删除，从而达到敲除的成效。将sgRNA序列构建入病毒载体中，再将Cas9序列装入另一载体中，随后两种病毒同时习染主张细胞进行敲除。

  lncRNA靶基因寻找：步骤根基类似于上面表述的miRNA双荧光素酶检测。

  3.circRNA: circRNA即环形RNA（circular RNA）的简称，是一类不拥有5’结尾帽子和3’ 结尾poly（A）尾巴、并以共价键形成环形结构的客观存在于生物体内的非编码RNA分子。

  circRNA重要特点：

  （1）circRNA由特殊可变剪切产生，大量存在与真核细胞的细胞质中，重要起源于表显子，少部门内含子起源的circRNA存在细胞核中。

  （2）表白水平拥有种属、组织、功夫特异性。

  （3）circRNA呈关合环状结构，不易被核酸表切酶降解，比线性RNA越发不变。

  （4）拥有肯定序列守旧性。

  （5）在转录或转录后水平阐扬调控作用。

  （6）绝大无数circRNA长短编码的，但也有少数能够翻译为多肽。

  circRNA凭据其起源可分为三类：表显子起源的circRNA（exonic circRNAs），内含子起源的circRNA（circular intronic RNAs，ciRNAs），以及由表显子和内含子共同组成的circRNA（retained-intron circRNAs）。

  circRNA的作用机造：

  miRNA分子海绵，circRNA含有大量的miRNA结合位点，拥有miRNA海绵作用，进而间接调控miRNA下游靶基因的表白。

 

  
 

  调控基因转录，circRNA也能够通过与RNA结合蛋白的结合来调控蛋白职能，好比通过与转录因子的结合来抑造基因的转录。

  编码职能，circRNA固然属于非编码RNA，但是也有少数circRNA能够编码多肽，通过该多肽行使调控职能。

  circRNA过表白：同上述的lncRNA步骤类似，但是circRNA过表白由于成环效能的影响，其难度相对通常基因的过表白更大。

  circRNA滋扰：同上述的lncRNA步骤步骤。

  circRNA敲除：同上述的lncRNA步骤步骤。

  circRNA靶基因寻找：同上述的miRNA和lncRNA双荧光素酶检测步骤。

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